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Mycoplasmes

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1. morphologie classification

Ce sont des bactéries sans paroi et incapables de produire les précurseurs de peptidoglycanes contrairement aux formes L ou les protoplastes. On ne trouve donc pas de PLP, protéines liant la pénicilline, chez les mycoplasmes. Elles forment une classe aux côtés des classes des Firmicutes (Gram +) et Gracilicutes (Gram -), la classe des Mollicutes (peau molle) ou Ténéricutes mais seraient dérivées de Clostridiums. Tous les mycoplasmes sont évidemment résistant aux bétalactamines.

Elles sont très fines (0,3 µm) et donc traversent les filtres de porosité 0,22 µm.

Elles sont très polymorphes, sont trouvées comme parasites (commensales ou pathogènes) des animaux et des plantes (spiroplasmes des agrumes), ou comme saprophytes.

Les Mycoplasmes parasites ont une forte tendance à se coller aux cellules car elles sont très généralement à la recherche de cholestérol, indispensable à la structure de leur membrane plasmique. Il existe des Mycoplasmes qui n'ont pas besoin de cholestérol.

Leur culture est difficile en particulier car leur génome est réduit (0,5 Gg mol^-1 ou 0,9 Mpb). Elles furent prises parfois pour des virus avec leur culture sur oeuf embryonné mais elles sont toutefois capables de multiplication sur milieu acellulaire... Ce sont pourtant les bactéries qui ont le plus petit génome tout en étant capables de multiplication autonome. La plupart sont des bactéries parasites des muqueuses. Leur GC% va de 23 à 35 environ.

	Niveau de classification	nombre d'espèces	taille du génome Mpb	besoin cholestérol	particularités	habitat
Ordre des Mycoplasmataceae
Famille des Mycoplasmataceae	Genre Mycoplasma	85	1	+		vertébrés
	Genre Ureaplasma	5	1,1	+	Uréase +	vertébrés
Ordre des Entomoplasmataceae	Famille Entomoplasmataceae	9	1,05	V		Insectes Plantes
	Famille Spiroplasmataceae	11	1,6	+	hélicoïdale	Insectes Plantes
Ordre des Acholeplasmataceae		9	1,6	-		tous
Ordre des Anaeroplasmataceae		5	1,5	V	anaérobies strictes	Rumen (ruminants)

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2. pouvoir pathogène

Il existe de nombreux mycoplasmes commensaux. Les espèces pathogènes sont très généralement des commensales. Les mycoplasmes pathogènes sont donc des pathogènes opportunistes dans l'état actuel de nos connaissances.

On peut distinguer de façon pratique :

• les Mycoplasmes respiratoires avec Mycoplasma pneumoniae est fréquemment responsable d'infections pulmonaires relativement bénignes (10 %) et suivies d'une bonne protection immunologique qui est essentiellement moléculaire (IgA, IgM des sécrétions)
  
• les Mycoplasmes génitaux ou uro-génitaux avec
  • Ureaplasma urealyticum est responsable d'urétrites chez l'homme (15 à 20 % des urétrites non gonococciques), d'infections génitales chez la femme bien que commensales chez 65 (15???) % des femmes...
  • Mycoplasma hominis responsable de salpingites chez la femme,
  • Mycoplasma genitalium qui semble responsable de métrites chez la femme.

On ne doit pas prendre ces données avec trop d'absolu : les infections à M. hominis sont possibles chez l'homme mais plus rares.

La comparaison du nombre de partenaires sexuels et de la positivité en mycoplasmes montre une forte transmission sexuelle.

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3. isolement et identification des mycoplasmes d'intérêt médical

Le diagnostic est difficile pour deux raisons :

• la grande difficulté de la culture
• la nécessité de faire une numération avant d'affirmer le rôle pathogène de la souche. (on considère le rôle pathogène à partir de 10⁴ mycoplasmes par mL)

3.1 milieux de culture

Les milieux de culture utilisés, obligatoirement isotoniques, sont à base de :

• NaCl
• glucose
• éventuellement DNA apportant les bases azotées nécessaires
• protéines
• extrait de levure
• sérum qui apporte notamment le cholestérol dans les lipoprotéines et bien d'autres ingrédients

Le pH doit être adapté aux espèces recherchées.

Bouillon A3 Composition finale pour 1 dm3 : bouillon trypticase-caséine-soja 24 g sérum de poulain non inactivé 200 mL ampicilline 100 kUI/mL 10 mL cystéine à 4 % 0,25 mL eau Un disque de kétoconazole peut être ajouté pour éliminer d'éventuels Candida.	Bouillon Arginine Composition finale pour 1 dm3 : bouillon PPLO 15 g pastone 7 g sérum de cheval 200 mL extrait de levure 100 mL rouge de phénol 1 % 2 mL ampicilline 0,4 g solution d'arginine 50 % 20 mL eau pH final = 7,2 ± 0,2
Bouillon Glucosé Composition finale pour 1 dm3 : bouillon PPLO 15 g pastone 7 g sérum de cheval 200 mL extrait de levure 100 mL rouge de phénol 1 % 2 mL ampicilline 0,4 g solution de glucose 50 % 10 mL eau pH final = 7,8 ± 0,2	Bouillon Urée (U9) Composition finale pour 1 dm3 : bouillon pour mycoplasmes 5 g pastone 2,5 g NaCl 5 g KH2PO4 0,2 g sérum de poulain non inactivé 40 mL cystéine à 4 % 2,5 mL rouge de phénol 1 % 1 mL ampicilline 100 kUI/mL 10 mL solution d'urée à 10 % 5 mL eau pH final = 6,0 ± 0,2
Gélose A6 Composition finale pour 1 dm3 : bouillon trypticase-caséine-soja 20 g sulfate de manganèse 0,3 g pastagar B 3,5 g extrait de levure 10 mL sérum de poulain non inactivé 200 mL cystéine à 4 % 2,5 mL ampicilline 100 kUI cm-3 10 mL solution d'urée à 10 % 10 mL eau pH final = 6,0 ± 0,2	-

3.2 Identification

L'identification peut reposer sur : (voir fiche Mérieux)

• la mise en évidence de l'ADH et de l'Uréase
• l'examen macroscopique des colonies et éventuellement de leur coloration par le MnO2.

	Mycoplasma pneumoniae	Mycoplasma fermentans	Mycoplasma hominis	Ureaplasma urealyticum
Voie d'attaque du glucose	fermentative du glucose	fermentative du glucose	glucose -	glucose -
Uréase	-	-	-	+
ADH	-	+	+	-
pH optimum	6,5 - 7,5	7,3 - 8	5,5 - 8	5,5 - 6,5
taille des colonies	-	100-300µm	100-300 µm	10-50 µm
forme	-	oeuf sur le plat	oeuf sur le plat	en oursin (brunes sur milieu au Mn)

3.3 Numération

On doit toutefois plutôt réaliser une numération selon les techniques suivantes:

technique simplifiée (Mycoplasma-Kit Mérieux) commercialisation abandonnée

• un bouillon Arginine Urée est ensemencé avec l'écouvillon
• trois gouttes de la suspension sont portées sur gélose A7

Après culture anaérobie ou µaérophile, la couleur du bouillon permet l'identification :

• rouge framboise : forte alcalinisation due à l'ADH (Mycoplasma hominis)
• rouge orange : alcalinisation plus faible montrant l'Uréase (Ureaplasma urealyticum)
• jaune orange : pas de changement (négatif)
• jaune citron : forte acidification à partir du glucose (Mycoplasma fermentans)

La gélose (A7) permet, en comparaison avec les abaques (pour la densité et la forme des colonies), de déterminer le nombre d'UFC et de conclure.

Les colonies, qui s'incrustent dans la gélose par leur centre avec une acumination leur donnant l'aspect d'oeuf sur le plat, ont les caractéristiques suivantes :

• Mycoplasma hominis : colonies en oeuf sur le plat de 100 à 300 µm.
• Ureaplasma urealyticum: colonies en oeuf sur le plat de 10 à 50 µm.
• Mycoplasma fermentans: colonies en oeuf sur le plat de 100 à 300 µm.

Deux types de colonies sont parfois observés dans le cas d'une forte alcalinisation : Mycoplasma hominis et Ureaplasma urealyticum peuvent en effet être associés dans le prélèvement.

On se reportera à l'abaque bioMérieux en cas de problème d'interprétation et pour le résultat de la numération.

PROTOCOLE

technique avec dilution (Pasteur mycoplasmes urogénitaux)

technique Mycoplasma IST

voir feuille technique

En résumé, cette technique repose sur l'ensemencement d'une galerie miniaturisée par un bouillon Arginine Urée dans lequel l'écouvillon de prélèvement a été porté. Il s'agit donc d'une dilution (approximative) du prélèvement. (en réalité, l'écouvillon est placé dans un milieu de transport qui sert à la mise en suspension du milieu Arginine Urée lyophilisé).

Les différentes cupules sont :

• une cupule Témoin 0 qui doit virer à l'alcalin (Rouge) sous l'effet de l'ADH ou de l'uréase. On peut supposer qu'elle contient une grande quantité d'A et U
• deux cupules permettant l'idenfication : l'une contient U et identifie Ureaplasma (rouge) et l'autre A et identifie Mycoplasma hominis. Il est pratiquement sûr qu'un antibiotique soit ajouté : Mycoplasma hominis résiste naturellement à l'érythromycine tandis que Ureaplasma urealyticum résiste à la lincomycine.
• deux cupules permettant la "numération" sur le même principe que précédemment : on peut supposer que c'est l'optimisation des concentration qui assure l'évaluation du nombre de mycoplasmes (plus de 10000 ou moins de 10000)
• onze cupules permettant l'antibiogramme : les dix premières assurent une lecture en concentration critique inf et sup, la dernière en inf seulement.

Remarque : la sérologie peut apporter des arguments intéressants notamment avec M. pneumoniae.

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4. traitement

Des vaccins sont en cours d'étude.
Les Mycoplasmes sont évidemment insensibles aux b-lactamines, mais aussi aux sulfamides, rifampicine et quinolones.
On utilise essentiellement les tétracyclines y compris pour les citronniers ...
Un antibiogramme en milieu spécial est possible par utilisation des galeries ATB ensemencées à l'aide d'un milieu approprié ou par la technique des dilutions par mesure de l'inhibition métabolique en microplaques. (voir ci-dessus)

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5. prophylaxie

Dans une certaine mesure, les protections adoptées dans le cadre de la lutte contre les MST sont efficaces pour les Mycoplasmes transmis génitalement.

compléments