Identifier, isoler le gène d’intérêt :

Il faut tout d’abord repérer le caractère intéressant que l’on veut transmettre au nouvel organisme vivant et identifier la protéine responsable de ce caractère. Le gène codant pour cette protéine, dit gène d’intérêt, peut provenir de n’importe quel organisme vivant puisque le code génétique est universel.
Pour identifier le gène d’intérêt, il faut prélever de l’ARNm codant pour la protéine recherchée. Grâce à une enzyme (transcriptase reverse), on peut obtenir la séquence d’ADN à partir de la séquence d’ARN. On  peut donc connaître la séquence de nucléotides du gène.
Le gène d’intérêt doit ensuite être isolé. Pour cela, il faut d’abord :

*Isoler l’ADN
L’ADN est une molécule complexe mais ont peut l’isoler relativement facilement des tissus vivants, grâce à ses propriétés chimiques particulières. Chez les plantes (et chez tous les organismes eucaryotes), l’ADN chromosomique se trouve dans le noyau des cellules. Pour l’extraire, il faut à partir d’un broyat de tissus, rompre les membranes de la cellule et du noyau pour libérer les chromosomes, par exemple en utilisant un détergent. L'ADN peut alors être isolé en utilisant le fait que les sels d’ADN sont insolubles dans l’alcool (ils forment un précipité)

*Couper l’ADN
Une fois que l’ADN est isolé, il faut le couper. En effet, les molécules d’ADN constituant les chromosomes sont beaucoup trop longues, complexes et fragiles pou être analysées facilement.
Au laboratoire, on préfère travailler sur de petits fragments contenant un ou quelques gènes. Des protéines bactériennes découvertes voilà trente ans, les enzymes de restriction, ont la particularité de couper l’ADN en des points spécifiques. Ces molécules du monde vivant reconnaissent une succession précise de quelques nucléotides de l’ADN (par exemple GAATTC) et le coupent au niveau de ce site. Cette étape de coupure est souvent appelée digestion de l’ADN.

*Isoler le gène dans le mélange de fragments.
Lorsque l’ADN est fragmenté, on utilise la technique du Southern Blot pour repérer le gène. Cette méthode consiste à séparer les fragments obtenus par électrophorèse en gels d’agarose puis à dénaturer l’ADN (séparation des deux brins de la double hélice) par immersion du gel dans une solution alcaline. Il faut ensuite fabriquer une sonde fluorescente ou radioactive complémentaire du gène d’intérêt et  la laisser s’hybrider avec la partie du brin d’ADN du gène recherché grâce à la complémentarité des bases. Puis grâce à une autoradiographie, on peut révéler les sites de fixation de la sonde radioactive sur l’ADN. Il suffit ensuite de prélever le gène sur le gel de l’électrophorèse.
 

Intégrer  le gène d’intérêt dans une construction

Le gène d’intérêt est intégré dans une construction génétique associant souvent un gène marqueur. Ce gène marqueur permet de sélectionner les cellules qui ont intégré le gène d’intérêt lors du criblage.
 

Amplifier le gène

La construction est ensuite multipliée afin de disposer d’une quantité suffisante d’ADN pour son introduction dans les cellules végétales que l’on veut transformer. Il existe deux méthodes qui permettent d’amplifier un gène :

Clonage
Des fragments d’ADN provenant d’une source quelconque peuvent être amplifiés plus d’un million de fois après insertion à l’intérieur d’un vecteur, qui peut être soit un virus bactérien (bactériophage) soit un plasmide, et intégration dans des cellules bactériennes ou des levures. Les plasmides sont de petites molécules d’ADN circulaires bicaténaires qui existent à l’état naturel chez les bactéries et les levures. Ces plasmides sont répliqués de la même manière que le reste du matériel génétique lors des divisions cellulaires. Après multiplication des cellules bactériennes ou des levures, on récupère l’ADN inséré.

1.Une enzyme de restriction isole le segment d’ADN qui contient le gène intéressant.
2.Un plasmide, fragment d’ADN extrait d’une bactérie, est mis en contact avec la même enzyme de restriction, et peut alors incorporer le segment d’ADN intéressant.
3.Le plasmide hybride est incorporé dans la bactérie, où il est dupliqué comme un ADN bactérien normal.
4.De très nombreuses cellules filles peuvent être obtenues par culture. Le gène incorporé permet la production de grandes quantités du gène par les bactéries.

PCR
Les techniques d’amplification de l’ADN (PCR, pour Polymerase Chain Reaction) utilisent une enzyme, l’ADN polymérase, capable de répliquer rapidement, in vitro, un fragment d’ADN quelconque, pourvu qu’y soient fixées des amorces (petits brins d’ADN complémentaires permettant d’initialiser la réaction de polymérisation).
Chaque cycle de PCR s’effectue en trois phases. La première consiste en la dénaturation par la chaleur de la double hélice d’ADN du fragment à amplifier. Les deux brins sont alors séparés. La température de la solution est ensuite abaissée, de façon à ce que les amorces puissent s’associer aux brins séparés (mais pas suffisamment pour que les deux brins se réassocient entre eux). La troisième phase est celle de la polymérisation proprement dite. La température est à nouveau augmentée, et l'ADN polymérase utilisé, qui reste actif même à de hautes températures, duplique les brins. À chaque nouveau cycle, l’enzyme duplique tous les brins d’ADN présents dans la solution, ce qui permet d’obtenir plus d’un million de copies du fragment de départ en seulement quelques heures.